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Overview

在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中，預(yù)防支原體污染可能是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。但是，您可以選擇易于清潔的移液器以及無(wú)菌耗材并定期檢測(cè)，通過(guò)執(zhí)行良好的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范，從而顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的支原體污染及傳播風(fēng)險(xiǎn)。

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《盡可能降低細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染風(fēng)險(xiǎn)》應(yīng)用說(shuō)明闡述了支原體污染的來(lái)源及預(yù)防措施。

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簡(jiǎn)介

在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中，支原體污染是一種普遍存在的現(xiàn)象：在一項(xiàng)研究中，研究人員測(cè)試了 10, 000 個(gè)細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其中的 11 % 存在支原體污染。支原體污染如此普遍的部分原因在于，即使在常規(guī)傳代培養(yǎng)中，其也能有效地傳播。而在另一項(xiàng)研究中，研究人員在層流凈化罩中處理受支原體感染的細(xì)胞培養(yǎng)物后，在燒瓶外壁、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上、移液器上以及廢棄培養(yǎng)皿外部都檢測(cè)到了活支原體。事實(shí)上，甚至在四到六天之后，從層流罩表面也回收到了活支原體。并且在處理過(guò)受支原體污染的細(xì)胞的同一個(gè)層流凈化罩內(nèi)傳代培養(yǎng)純凈的培養(yǎng)物 6 周后，也檢測(cè)到支原體呈陽(yáng)性。

什么是支原體

支原體是一類沒有細(xì)胞壁的細(xì)菌。由于缺少細(xì)胞壁，它們可以呈現(xiàn)不同的形狀，從圓形到細(xì)長(zhǎng)形都有，并對(duì)抗生素具有耐藥性。支原體體積小（0.2 – 0.8 μm），可穿過(guò)除菌級(jí)過(guò)濾器，這使其成為一種非常難以去除的污染物。此外，體積小也導(dǎo)致其難以在細(xì)胞培養(yǎng)中被發(fā)現(xiàn)。

在細(xì)胞培養(yǎng)中，支原體可抑制蛋白質(zhì)生物合成以及細(xì)胞生長(zhǎng)，并會(huì)改變RNA和DNA合成，從而影響研究結(jié)果。在細(xì)胞治療和先進(jìn)治療藥物產(chǎn)品（ATMP）中，支原體污染會(huì)引起免疫反應(yīng)、染色體畸變或增殖特性改變，從而影響患者的治療安全性。

支原體污染的潛在途徑包括：

- 受污染的培養(yǎng)基、試劑或儀器

- 實(shí)驗(yàn)室人員（約 80.6 %的技術(shù)人員為支原體攜帶者）

- 其他實(shí)驗(yàn)室的被感染培養(yǎng)物


支原體留存在移液器表面

移液器經(jīng)常暴露在污染物中，并可能攜帶污染物。通過(guò)對(duì)移液器高壓滅菌和乙醇擦拭的去污效率比較顯示，用 70 %乙醇去污可使回收到的細(xì)菌數(shù)量減少一個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)以上，而對(duì)移液器進(jìn)行高壓滅菌可以*去除其中的支原體污染。

為降低支原體污染風(fēng)險(xiǎn)，請(qǐng)使用可高壓滅菌的移液器進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)工作。賽多利斯整支可高壓滅菌的Tacta®移液器是細(xì)胞培養(yǎng)工作的好選擇。

避免支原體污染的良好實(shí)踐

您可以通過(guò)以下操作規(guī)程進(jìn)行無(wú)污染的細(xì)胞培養(yǎng)：

1. 實(shí)施良好細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范

《良好的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范》中的關(guān)鍵指導(dǎo)原則包括：一次只培養(yǎng)一個(gè)細(xì)胞系；清晰標(biāo)記用于細(xì)胞培養(yǎng)工作的移液器、移液助吸器及移液器吸頭；僅在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室使用這些移液器和吸頭；禁止將其從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，然后再轉(zhuǎn)移回來(lái)。只能使用專為細(xì)胞培養(yǎng)工作定制的試劑，不得使用專用于其他應(yīng)用的儲(chǔ)備溶液。

2. 選擇易于清潔且可高壓滅菌的移液器用于細(xì)胞培養(yǎng)工作

液體溢漏和飛濺是造成污染的主要來(lái)源，而移液器和液體處理控制器的維護(hù)在降低這類污染風(fēng)險(xiǎn)方面發(fā)揮著重要的作用。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)針對(duì)定期的去除污染和維護(hù)作業(yè)制定相關(guān)指南和方案。去除細(xì)菌污染的有效清潔方法包括：

- 高壓滅菌

- 堿性清潔劑

- 乙醇過(guò)氧化氫蒸汽VHP


賽多利斯Tacta®移液器只需拆卸三個(gè)部件即可清潔，而且拆卸操作無(wú)需使用工具。Tacta® 還可以整支進(jìn)行蒸汽消毒或熱壓滅菌，它還具有強(qiáng)大的紫外線耐受力和耐化學(xué)腐蝕性。

3. 選擇帶有防護(hù)包裝的無(wú)菌濾芯吸頭

濾芯吸頭是細(xì)胞培養(yǎng)工作中安全的選擇，因其為樣本和移液器提供了優(yōu)質(zhì)的防護(hù)，并且可以防止支原體通過(guò)氣溶膠傳播。

4. 定期檢測(cè)

定期檢測(cè)所有細(xì)胞系的支原體污染情況，尤其是新細(xì)胞系。將新細(xì)胞系隔離在單獨(dú)的培養(yǎng)箱中，直到可以明確證明其未受支原體污染。

賽多利斯Microsart支原體檢測(cè)試劑盒，采用RT-PCR的方法， 3小時(shí)內(nèi)即可獲得可靠結(jié)果。高特異性Taqman探針，無(wú)需擔(dān)心假陽(yáng)性結(jié)果，并且*符合EP 2.6.7法規(guī)要求。

5. 使用 0.1 μm的濾器過(guò)濾

高壓滅菌是殺死支原體的有效方法，但不適用于某些培養(yǎng)基和試劑，因?yàn)楦邷貢?huì)破壞許多營(yíng)養(yǎng)素和生長(zhǎng)因子。對(duì)于細(xì)胞大小為 0.2 - 0.8 μm且可通過(guò)孔徑大于 0.1 μm孔的支原體而言，能有效防止細(xì)菌和真菌通過(guò)的孔徑為 0.22 μm的標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌過(guò)濾通常是不夠的。因此，為防止支原體污染，在過(guò)濾細(xì)胞培養(yǎng)試劑和培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)使用 0.1 μm孔徑的無(wú)菌過(guò)濾器，而不是標(biāo)準(zhǔn)的 0.22 μm過(guò)濾器。

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